激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它能將水平分辨率提高40以上，優(yōu)勢可達(dá)120nm。針孔的存在有效去除雜散光，使圖像更清晰、細(xì)節(jié)更豐富，讓研究人員能觀察到更細(xì)微的結(jié)構(gòu)?？芍饘荧@得二維光學(xué)橫斷面圖像，借助計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行三維重建，直觀呈現(xiàn)樣品內(nèi)部復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，有助于深入了解細(xì)胞形態(tài)、組織架構(gòu)及分子分布等。
支持同時(shí)使用多種熒光探針標(biāo)記不同的細(xì)胞或分子成分，在同一視野下區(qū)分并觀察它們的位置和相互關(guān)系，為研究細(xì)胞內(nèi)多種元素的動態(tài)變化提供便利。具有良好的時(shí)效性與適應(yīng)性，可在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行長時(shí)間實(shí)時(shí)觀察，記錄細(xì)胞的生長、分裂、遷移等動態(tài)過程，對生物醫(yī)學(xué)研究意義重大。能獲取高清晰度、反差明顯的光學(xué)切片圖，準(zhǔn)確反映樣品不同層次的信息，方便對樣品進(jìn)行分層研究和分析。
激光共聚焦顯微鏡的使用步驟：
1.參數(shù)設(shè)置
-選擇激光與濾光片：根據(jù)熒光探針的激發(fā)與發(fā)射波長，挑選合適的激光、激光功率、光譜濾光片和發(fā)射濾光片。
-確定掃描方式：可選擇點(diǎn)、線、面或3D掃描等不同的掃描方法。
-設(shè)定分辨率：分辨率越高，掃描速度越慢，但圖像信噪比越好，不過可能出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，需權(quán)衡后確定合適的掃描密度(分辨率)。
-選取物鏡及放大倍率：先選擇物鏡的倍數(shù)及電子放大倍率，再據(jù)此選擇掃描范圍。由于物鏡的透光率與數(shù)值孔徑(NA)的四次方成正比，且與物鏡放大倍數(shù)的平方成反比，所以應(yīng)盡量選用高數(shù)值孔徑的物鏡。
-調(diào)整其他參數(shù)：依據(jù)樣品制備質(zhì)量，選擇合適的針孔尺寸，并調(diào)節(jié)激光管電壓、光電倍增管功率、降噪等，使設(shè)備達(dá)到良好的工作狀態(tài)。
2.觀察與定位
-初步觀察：通過目鏡對樣品進(jìn)行初步觀察，找到感興趣的區(qū)域。
-準(zhǔn)確定位：當(dāng)在目鏡下確定準(zhǔn)確的樣品位置后，設(shè)置通道數(shù)量和激發(fā)模塊。
3.圖像采集
-開始掃描：按照設(shè)定好的參數(shù)啟動掃描程序，獲取樣品的圖像數(shù)據(jù)。在長時(shí)間成像過程中，要注意避免激光的高強(qiáng)度照明導(dǎo)致活細(xì)胞的光毒性或固定標(biāo)本的光漂白現(xiàn)象。為此，可在保證成像清晰的前提下，適當(dāng)降低激光強(qiáng)度，并提高增益；同時(shí)避免長時(shí)間連續(xù)曝光，可根據(jù)需要調(diào)整拍攝間隔。
-自動對焦輔助：長時(shí)間成像可能導(dǎo)致焦點(diǎn)漂移，此時(shí)可結(jié)合自動對焦功能確保圖像清晰度。
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更新時(shí)間：2025-10-21 
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