熒光定量PCR可實時監(jiān)測反應過程中的熒光強度變化

更新時間：2025-08-06

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　　熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展起來的一種核酸定量技術。其核心原理基于熒光信號與PCR擴增產(chǎn)物量之間的對應關系，通過在PCR反應體系中加入熒光基團或熒光標記物，實時監(jiān)測反應過程中熒光強度的變化，從而對起始模板核酸的量進行定量分析。

　　(一)熒光標記方式

　　1.TaqMan探針法

　　-TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，其5'端標記有熒光報告基團(如FAM)，3'端標記有熒光淬滅基團(如TAMRA)。在未進行PCR擴增時，由于探針的完整性，熒光報告基團與淬滅基團空間位置接近，發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)，熒光報告基團被淬滅，此時檢測不到熒光信號。

　　-當進行PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針降解，使得熒光報告基團與淬滅基團分離，熒光報告基團被激發(fā)后發(fā)出熒光，其熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號不斷增強，通過檢測熒光強度即可對模板核酸進行定量。

　　2.SYBR Green I染料法

　　-SYBR Green I是一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料。在PCR反應的變性階段，SYBR Green I游離于溶液中，此時熒光信號較弱。

　　-在退火和延伸階段，隨著雙鏈DNA的形成，SYBR Green I與雙鏈DNA結合，其熒光強度會顯著增強。由于熒光信號強度與雙鏈DNA的含量相關，而雙鏈DNA的含量又與PCR擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此可以通過檢測SYBR Green I的熒光強度來監(jiān)測PCR擴增過程并進行定量分析。不過，SYBR Green I與非特異性雙鏈DNA(如引物二聚體)結合也會產(chǎn)生熒光，所以需要通過熔解曲線分析來區(qū)分特異性擴增產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物。

　　(二)熒光定量PCR的原理

　　在PCR反應的指數(shù)增長期，擴增產(chǎn)物的量與起始模板核酸的量存在確定的數(shù)學關系。通過對熒光信號的實時監(jiān)測，可以得到擴增產(chǎn)物的熒光強度隨循環(huán)數(shù)變化的曲線。根據(jù)已知濃度的標準品制作標準曲線，將待測樣品的熒光信號與標準曲線進行比較，就可以計算出待測樣品中起始模板核酸的拷貝數(shù)或濃度，從而實現(xiàn)對核酸的準確定量。