熒光定量PCR可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的熒光強(qiáng)度變化

更新時(shí)間：2025-08-06

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　　熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸定量技術(shù)。其核心原理基于熒光信號(hào)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或熒光標(biāo)記物，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中熒光強(qiáng)度的變化，從而對(duì)起始模板核酸的量進(jìn)行定量分析。

　　(一)熒光標(biāo)記方式

　　1.TaqMan探針法

　　-TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，其5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(如FAM)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(如TAMRA)。在未進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，由于探針的完整性，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)空間位置接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光報(bào)告基團(tuán)被淬滅，此時(shí)檢測(cè)不到熒光信號(hào)。

　　-當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針降解，使得熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光報(bào)告基團(tuán)被激發(fā)后發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度即可對(duì)模板核酸進(jìn)行定量。

　　2.SYBR Green I染料法

　　-SYBR Green I是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。在PCR反應(yīng)的變性階段，SYBR Green I游離于溶液中，此時(shí)熒光信號(hào)較弱。

　　-在退火和延伸階段，隨著雙鏈DNA的形成，SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增強(qiáng)。由于熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的含量相關(guān)，而雙鏈DNA的含量又與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此可以通過檢測(cè)SYBR Green I的熒光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程并進(jìn)行定量分析。不過，SYBR Green I與非特異性雙鏈DNA(如引物二聚體)結(jié)合也會(huì)產(chǎn)生熒光，所以需要通過熔解曲線分析來區(qū)分特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物。

　　(二)熒光定量PCR的原理

　　在PCR反應(yīng)的指數(shù)增長(zhǎng)期，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板核酸的量存在確定的數(shù)學(xué)關(guān)系。通過對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可以得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨循環(huán)數(shù)變化的曲線。根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品的熒光信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，就可以計(jì)算出待測(cè)樣品中起始模板核酸的拷貝數(shù)或濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的準(zhǔn)確定量。